歡迎關(guān)注「漢莎科技集團」微信公眾號！

植物材料&處理方法(Material andmethods)

選用紫薇（Lagerstroemia indica Linn.）長(cháng)勢均勻、朝向一致的成熟葉，60℃熱水分別浸沒(méi)0s、10s、30s和60s熱脅迫處理。

快速葉綠素熒光誘導動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(OJIP polyphasic chlorophyll Chl a fluorescence rise kinetics)

使用Handy PEA(Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK)測定，時(shí)長(cháng)2s，光強3000 μmol·m^–2·s^–1。測定前所有樣品由暗適應夾遮光處理30min。依據JIP-test能量流動(dòng)模型理論(Strasser et al. 2004)熒光參數由PEA Plus軟件直接計算并導出。

根據Springer Nature 2018出版的《Advances in Plant Ecophysiology Techniques》歸類(lèi)總結的熱脅迫對快速Chl熒光(OJIP)參數的影響(點(diǎn)擊這里閱讀此文)選擇相應敏感參數進(jìn)行PCA分析，所選JIP-test熒光參數介紹詳見(jiàn)文末附表1。

數據分析軟件(Statistical analysis)

數據PCA分析處理及作圖分別使用IBM SPSS Statistics 26(IBM Corp)和Excel 2016(Microsoft Corp)。

操作步驟(Operation Steps)

一、    原始數據的導出&預處理

樣品測定結束后，通過(guò)PEA Plus軟件對樣品數據進(jìn)行分組預處理、導出并標準化處理OJIP曲線(xiàn)和導出JIP-test熒光參數，詳細操作方法點(diǎn)擊這里查看視頻教程。

二、PCA主成分分析操作步驟

1. 將JIP-test熒光數據導入SPSS軟件后，如上圖點(diǎn)擊工具欄“分析”→“降維”→“因子”，彈出PCA分析設置對話(huà)框。

2. 如下圖，將選定的需要進(jìn)行PCA分析的JIP-test熒光參數導入至“變量”欄中。

3. 點(diǎn)擊“描述”，選中“KMO和巴特利特球形度檢驗”：使用主成分分析進(jìn)行信息濃縮研究，首先應分析研究數據是否適合進(jìn)行主成分分析。

(i)分析KMO值：如果此值高于0.8，則說(shuō)明所選數據非常適合進(jìn)行PCA分析；如果此值介于0.7~0.8之間，則說(shuō)明比較適合進(jìn)行PCA分析；如果此值介于0.6~0.7，則說(shuō)明可以進(jìn)行PCA分析；如果此值小于0.6，說(shuō)明不適合進(jìn)行PCA分析；

(ii)如果Bartlett檢驗對應p值小于0.05也說(shuō)明適合進(jìn)行主成分分析。

4. 點(diǎn)擊“提取”，選擇顯示“碎石圖”，提取“因子的固定數目”為2。

碎石圖用于輔助判斷主成分提取個(gè)數，當折線(xiàn)由陡峭突然變得平穩時(shí)，陡峭到平穩對應的主成分個(gè)數即為參考提取主成分個(gè)數。

碎石圖僅輔助決策主成分個(gè)數，實(shí)際研究中更多以專(zhuān)業(yè)知識，結合主成分與研究項對應關(guān)系情況，綜合權衡判斷得出主成分個(gè)數，此處我們選擇提取的主成分個(gè)數即“因子的固定數目”為2。

5. 點(diǎn)擊“旋轉”，選擇旋轉方法為“最大方差法”，并選擇顯示“載荷圖”。

使用最大方差法使得降維后同一緯度的方差最大且不同維度之間的相關(guān)性為0，而載荷圖用于展示各成分與載荷值關(guān)系情況或各成分再不同維度上的分布情況。

6. 點(diǎn)擊“得分”，選擇因子得分"保存為變量"，并“顯示因子得分系數矩陣”

通過(guò)因子得分系數，分析出各JIP-test熒光參數與各主成分因子(PC1&PC2)的對應關(guān)系或相關(guān)性情況。7. 點(diǎn)擊“選項”，選擇系數顯示格式“禁止顯示小系數”且絕對值為0。設置絕對值為0可顯示全部因子得分系數，可用于后續聚類(lèi)分析處理。8. 點(diǎn)擊“確定”即可得出PCA分析結果。

三、PCA主成分分析結果查驗

1. 彈出PCA分析結果查看器后，首先如下圖查看“KMO值”(＞0.6)和“巴特利特球形度檢驗顯著(zhù)性p值”(＜0.05)是否符合PCA分析要求。

2. 查看PCA提取因子PC1&PC2對所有參數的提取分離度，如下圖PC1和PC2對所有參與分析參數的累積分離度分別為59.643%和32.042%，PC1&PC2共同的累積分離度為91.685%，表明經(jīng)PCA處理分析得到的兩個(gè)成分因子可對所選參數有極佳的分離描述度。同時(shí)通過(guò)“碎石圖”可更直觀(guān)的查看各成分因子(PC1、PC2...)對參數的累計分離度。

3. 初步預覽所選JIP-test參數“旋轉后的成分矩陣”以及在由PC1&PC2組成的二維平面上的分布情況。該成分矩陣表用于后期參數分布圖的制圖。

4. 返回“數據編輯器”預覽經(jīng)PCA分析后新生成保存的各樣品“主成分因子得分表"，表明各樣品在PC1&PC2的得分情況，該得分表用于后續所有測定樣品的聚類(lèi)分析。

四、PCA主成分分析結果的可視化操作

n  聚類(lèi)分析——樣品和JIP-test參數主成分聚類(lèi)分析的可視化

將所有樣品“主成分因子得分表”和JIP-test參數“旋轉后的成分矩陣”復制至新建Excel表中。

1. 選中同一處理組樣品的PC1&PC2得分，點(diǎn)擊”插入“→”散點(diǎn)圖“。

2. 在新生成散點(diǎn)圖處，點(diǎn)擊鼠標右鍵→點(diǎn)擊”選擇數據“→分別設置各處理組系列名稱(chēng)及X軸、Y軸對應數據，詳細操作見(jiàn)下方視頻。

3. JIP-test參數在主成分坐標系中的分布同樣品聚類(lèi)分析操作類(lèi)似，選中所有參數PC1&PC2得分插入散點(diǎn)圖即可。

詳細操作步驟請查看本試驗下方教程視頻：

n  參數分布變化——單一處理組JIP-test參數主成分分布可視化

除將所有處理組共同聚類(lèi)分析外，如下圖還可將不同處理組JIP-test參數分布變化進(jìn)行對比。

1. 在SPSS軟件中將不同處理組樣品參數分別進(jìn)行PCA主成分分析。

2. 獲得單一處理組PCA分析結果后，將該組JIP-test參數“旋轉后的成分矩陣”復制到Excel中。

3. 為獲得每一參數點(diǎn)箭頭指示連接符，需將各JIP-test參數在坐標系中的位點(diǎn)轉換為向量值。

4. 在每一參數上部添加一空白行，并輸入原點(diǎn)"0"。

5. 選中單一參數數據，插入散點(diǎn)圖，分別設置X軸&Y軸坐標為連接原點(diǎn)的向量值。以新系列形式逐一添加所有參數至散點(diǎn)圖中。

6. 設置箭頭顏色、樣式，隱藏數據點(diǎn)，添加系列標簽，標記分簇即可。

單一處理組JIP-test參數主成分分布可視化詳細操作教程見(jiàn)下方視頻：

結果分析(Result)

通過(guò)PCA技術(shù)分析發(fā)現，所選的JIP-test參數形成了三個(gè)較好分離的簇。其中兩個(gè)位于PC1(Cluster 1&3)上，一個(gè)位于PC2(Cluster 2)上。每一組參數描述了不同的生理過(guò)程：光能捕獲和傳遞階段(Cluster 1)、電子傳遞鏈末端性能(Cluster 2)和耗散階段(Cluster 3)。PC1對應PSII活性，較高的值表示更高的PSⅡ性能(低光吸收、高光化學(xué)和電子傳輸效率)，代表參數包括Fv/Fm、PIABS、ABS/RC、DIo/CSm等；PC2則對應PSⅠ活性，較高的值表明PSⅠ性能較高，代表參數包括φRo、δRo、REo/RC等。

對實(shí)驗對照和處理進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現，對照集中在Cluster1附近，隨著(zhù)脅迫程度的加深，聚類(lèi)的位置也在發(fā)生改變：10s處理位于Cluster1和Cluster2之間，30s處理位于Cluster2和Cluster3之間，60s處理位于Cluster3附近。

結合參數分析，對照表現出較高的PS2性能，10s處理的PS2性能出現受損，30s處理則表現出較低的PS2性能和較高的PSⅠ性能，60s處理的PSⅠ和PSⅡ性能表現最差。

以上分析說(shuō)明，高溫處理較短時(shí)間會(huì )損傷PSⅡ的性能，但是PSⅠ的性能會(huì )相對提高；時(shí)間過(guò)長(cháng)，PSⅠ和PSⅡ性能都會(huì )被破壞。

如下兩圖為對照組和高溫處理后，被測參數主成分分布關(guān)系的變化。對照實(shí)驗中，Fv/Fm、PIABS、ETo/CSm等光系統PSⅡ性能相關(guān)參數聚集在PC2上；φRo、δRo、REo/CSm等光系統PSI相關(guān)參數則在PC1上；ABS/RC、Mo、Wk三個(gè)參數成簇，位于PC1上；DIo/CSm近乎在原點(diǎn)。

60s高溫處理后，PSⅡ相關(guān)參數轉移到PC1上，PSⅠ相關(guān)參數轉移到PC2上，ABS/RC、Mo與DIo/CSm聚集成簇，Wk轉移到PC2上。

以上變化表明，高溫處理主要影響PSⅡ的性能，ABS/RC、Mo與DIo/CSm則減弱高溫處理的影響，ABS/RC代表光捕獲，Mo代表能量傳遞，DIo/CSm代表耗散，這三個(gè)參數越大，代表樣品的耐熱性越強。

另附上熱處理紫薇OKJIP曲線(xiàn)，詳細制圖方法本文不再詳細介紹，可點(diǎn)擊下面鏈接查看詳細視頻教程。

[研究方法]|PEA植物效率分析儀數據處理方法（視頻）

附表1. 熱脅迫JIP-test熒光參數PCA分析所選參數